夾心法（SandwichELISA）分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

　　小鼠血栓素B2試劑盒中抗原的2個不同的抗原表位被兩個抗體——捕捉抗體和檢測抗體，分別結合。捕捉抗體固定于載體即酶標板上，檢測抗體通過結合抗原進行顯色分析。應用于雙抗體夾心法檢測的捕捉抗體通常是單抗，偶爾有用多抗做為捕捉抗體的情況，但很少見，因為以多抗作為捕捉抗體容易出現交叉反應而降低特異性。檢測抗體通常為多抗，在商業化的科研試劑盒中經常用到標記的山羊多抗，再讓標記的多抗與HRP標記的親和素或者鏈霉親和素結合，然后再加HRP也就是辣根過氧化物酶的底物，通常是TMB反應顯色，這種方法是在傳統的HRP酶標記抗體的雙抗體夾心法ELISA中引入了-親和素放大系統。不過也有用單抗做檢測抗體的情況，尤其是在科研中。雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優勢，但該法只適用于有多個結合位點的抗原檢測，主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫學檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關的，以及在科研中檢測細胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測過程中有時會將樣本和酶標抗體同時加入進行反應，稱為雙抗體夾心一步法，因為操作時間短，在商業化生產中有很大優勢。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應（hookffect），因為此時如果樣本中抗原含量過高會導致其與固相抗體和酶標抗體均有結合而無法形成“夾心復合物"，此時測出的結果將低于實際含量甚至是陰性結果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測定樣本中抗原含量時要注意測量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應。